Kultur Jaringan Tebu

PENDAHULUAN

Kultur jaringan (tissue culture) atau budidaya in vitro adalah suatu budidaya sekelompok sel, jaringan, atau organ, di atas media dengan nutrisi dalam kondisi steril, sehingga bagian-bagian tersebut dapat memperbanyak diri dan beregenerasi menjadi tanaman lengkap. Pada mulanya, orientasi teknik kultur jaringan hanya pada pembuktian teori totipotensi sel. Totipotensi adalah kemampuan yang dimiliki oleh jaringan tumbuhan, dalam lingkungan yang sesuai dan memenuhi kebutuhan nutrisinya, akan tumbuh menjadi anaman baru yang lengkap.  Kemapuan totipotensi sel terjadi oleh karena potensi genetic suatu sel akan diwariskan kepada sel-sel anakannya, demikian seterusnya.

Kultur jaringan kemudian berkembang menjadi sarana penelitian fisiologi dan biokimia. Pada akhirnya teknik kultur jaringan telah mengarah ke bidang agro-industri.

Istilah-istilah di dalam kultur jaringan

1. Adventif (akar adventif): adalah akar yang terbentuk pada suatu bagian tanaman/ jaringan, yang bukan merupakan akar yang berasal dari embrio.
2. Apical dominance = dominansi apikal: adalah hambatan pertumbuhan tunas lateral oleh tunas pucuk/ apikal.
3. Aseptik: Bebas kuman, bebas patogen. Disebut juga steril. Patogen adalah jasad renik yang mengganggu/ menimbulkan penyakit.
4. Browning reaction = reaksi pencoklatan: adalah terbentuknya warna coklat pada jaringan segar yang dipotong. Warna coklat terbentuk karena adanya reaksi oksidasi senyawa fenol.
5. Klon : Kumpulan tanaman yang dihasilkan secara vegetatif, sehingga mempunyai sifat genetik yang sama.
6. Kalus : adalah kumpulan sel yang belum terdiferensiasi.
7. Embrioid : Adalah struktur seperti embrio yang terbentuk dari sel vegetatif dalam kultur jaringan.
8. Eksplan : Adalah bagian organisme/ tanaman yang digunakan sebagai bahan tanam dalam kultur jaringan.
9. Suspensi sel : Adalah agregat sel di dalam media cair.

PELAKSANAAN KULTUR JARINGAN

Dalam kultur jaringan, pertumbuhan eksplan diusahakan dalm lingkungan aseptic dan terkendali. Implikasi dari keadaan ini adalah setiap langkah dalam pelaksanaannya harus dilakukan dalam laboratorium. Laboratorium yang efektif merupakan salah satu unsur yang penting yang ikut menentukan keberhasilan pekerjaan, baik untuk penelitian maupun produksi. Laboratorium kultur jaringan sebaiknya mempunyai pembagian ruang yang diatur sedemikian rupa sehingga tiap kegiatan terpisah satu dengan lainnya, tetapi juga saling berhubungan dan mudah dicapai.

I.                   LABORATORIUM KULTUR JARINGAN

            Penataan ruang dalam laboratorium dikaitkan dengan langkah-langkah dalam prosedur kultur jaringan dan alat-alat yang dibutuhkan. Kegiatan kultur jaringan di dalam laboratroium dibagi dalam 3 kelompok yaitu:

1. Persiapan, baik persiapan media maupun persiapan bahan tanam
2. Isolasi dan penanaman
3. Inkubasi dan penyimpanan kultur

Karena kegiatan tersebut maka ruang yang dibutuhkan adalah:

1. Ruang persiapan
2. Ruang transfer
3. Ruang kultur
4. Ruang stok, yang dapat disatukan dengan ruang persiapan

Dalam merencanakan laboratorium kultur jaringan, perlu diperhatikan beberapa hal,yaitu:

1. Ruang yang efektif
2. Kapasitas produksi yang diinginkan
3. Sumber dana
4. Suasana kerja

Ukuran tiap ruang tergantung dari:

1. Alat-alat yang dipergunakan
2. Jumlah personalia yang terlibat
3. Tujuan pekerjaan
4. Besarnya unit produksi dan biaya yang tersedia

Sarana dasar yang diperlukan :

1. Aliran listrik
2. Air yang lancar

Kebutuhan minimal peralatan dalam laboratorium:

1. Hot plate atau kompor kecil
2. Sterilizer,/ autoklaf
3. Laminar air flow atau entkas
4. pH meter atau pH stick
5. Timbangan centigram
6. Gelas-gelas, botol-botol, dan sebagainya
7. Tempat cuci
8. Desinfectant
9. Alat-alat kecil: scalpel, pisau, pinset, gunting
10. Rak-rak
11. Alat pencampur
12. Bunsen burner

1. Ruang Persiapan

Ruang ini dipergunakan untuk mempersiapkan:

v  Media kultur dan bahan tanam

v  Mencuci alat laboratorium

v  Menyimpan alat gelas

Fasilitas yang dibutuhkan dalam ruang ini:

v  Meja tempat alat pemanas

v  Meja untuk alat timbang

v  Meja untuk bekerja

v  Tempat cuci

Kegiatan yang dilakukan dalam ruang ini:

v  Penimbangan bahan

v  Pengenceran media dan penuangannya

v  Sterilisasi alat dan media

v  Persiapan bahan tanam:

1.      Pencucian kotoran-kotoran dari lapangan

2.      Pembuangan dan pemotongan bagian-bagian yang tidak diperlukan

3.      Perlakuan awal untuk mengurangi sumber kontaminasi pada permukaan bahan tanam

Peralatan yang ada dalam ruang ini:

v  Timbangan analitik

v  Almari es untuk larutan stok

v  Hot plate atau kompor kecil

v  Bunsen burner dengan kaki tiga

v  Oven (tidak harus ada)

v  PH meter atau pH stick

v  Autoklaf

v  Alat-alat gelas standard: labu takar, pipet, Erlenmeyer, gelas piala, pengaduk gelas, wadah kultur

v  Alat untuk mencuci

v  Rak pengering

v  Alamari alat dan bahan kimia serta bahan-bahan lain

v  Alat-alat kecil

2. Ruang Transfer

Merupakan ruang untuk kerja aseptic.

Kegiatan dalam ruang ini:

v  Isolasi bahan tanam

v  Sterilisasi Eksplan

v  Penanaman eksplan dalam media

Ruang ini:

1.      Bebas debu dan hewan kecil

2.      Tersekat dengan ruang lain

3.      Pintu penghubung selalu tertutup

4.      Dibersihkan dengan bahan desinfektan

Alat-alat dalam ruang transfer:

v  Laminar Air Flow atau entkas

v  Alat-alat diseksi: scalpel, pinset, spatula, gunting

v  Bunsen burner

3. Ruang Kultur

Merupakan ruang besar dengan kemungkinan perluasan.

Ruang ini:

1.      Harus dijaga kebersihannya

2.      Hindari lalu lalang orang-orang

3.      Kemungkinan perluasan karena pertambahan kultur karena subkultur atau pertambahan jenis baru

Alat-alat dalam ruang ini:

v  Rak-rak terbuka dan bersusun dengan jarak 40 – 50 cm. Jarak antar rak diatur untuk memudahkan lalu lintas pemeriksaan kultur

v  Alat penunjang (penggaris, kaca pembesar, shaker, tangga pendek, dll.)

Kegiatan dalam ruang ini:

Menjaga lingkungan fisik untuk pertumbuhan: Cahaya: Kualitas cahaya (cahaya putih adalah yang terbaik); Intensitas cahaya: 100-400 ft.c (1000 – 4000 lux); Panjang penyinaran (14 – 16 jam); serta temperatur (25 – 28 °C).

II.                MEDIA KULTUR JARINGAN

            Keberhasilan dalam penggunaan metode kultur jaringan sangat tergantung pada media yang digunakan. Media kultur tersusun dari beberapa atau seluruh komponen berikut:

1. Hara makro  dan hara mikro yang digunakan pada semua media
2. Vitamin-vitamin
3. Gula
4. Asam amino
5. Persenyawaan organic kompleks alamiah seperti air kelapa, ekstrak ragi, juice tomat, ekstrak kentang, dan sebagainya.
6. Arang aktif (jika dibutuhkan)
7. Buffer
8. Zat pengatur tumbuh terutama auksin dan sitokinin
9. Bahan pemadat (agar)

Media dan Cara Pembuatan Media

Salah satu keberhasilan kultur jaringan adalah pemberian nutrisi dalam jumlah dan perbandingan yang sesuai pada media. Media pada urrumnya terdiri dari garam-ga ram anorganik yang meliputi unsur hara makro da mikro, zat organik dan senyawa organik kompleks yang tidak diketahui pasti komposisinya.

A.    Bahan-bahan Pembuatan media kultur Jaringan

 Media Murashige dan Skoog

1. Garam-garam anorganik

Kebutuhan mineral dalam kultur jaringan kurang lebih sama dengan tanaman utuh. Garam-gararn mineral merupakan gabungan unsur-unsur hara makro dan mikro.

a. Hara Makro

Hara makro dibutuhkan dalam jumlah besar, terdiri dari C, H, 0, N, S, P, K, Ca, Mg. Hara makro diberikan dalam bentuk persenyawaan, pada media MS terdiri dari:

NH4NO3, KN0₃, CaC1₂,2H₂0, MgS0₄.H₂O, KH2PO4.

·         Nitrogen dibutuhkan untuk menyusun asarn amino, klorofil, alkaloid, derivat purin, dan pirimidin, serta senyawa lain yang mengandung N.

·          Be!erang diperlukan untuk senyawa imunoglobulin, serta beberapa molekul protein,

·          Fosfat merupakan bagian dari senyawa RNA, DNA, serta energi kimia ATP dan pereduksi.

·         Kalium berperan dalam metabolisme dan transpor  nutrien.

·         Calcium diperlukan dalam pembentukan Ca pektat pada lamela tengah (dinding sel), permeabilitas membran, sistem tanspor nutrien

·         Magnesium merupakan inti klorofil, Mg pektat, aktivator enzim terutama pada fosforilasi dan pada sintesis protein.

b. Hara Mikro

      Hara mikro Fe. Mn. Zn, B, Cu, Mo, Co adalah komponen protein sel tanaman yang peniing dalam proses metabo'isme. Bentuk persenyawaan hara mikro pada media MS adalah: FeSO₄.7H₂0, Na₂EDTA, MnSO₄,H₂O, ZnS0₄.7H₂0, H₃BO₃, KI, CuS0₄.5H₂O, Na₂Mo₄.2H₂O, COCl₂.6H₂O.

• Besi dibutuhkan sedikit lebih banyak daripada unsur mikro yang lain. Fe berperan penting dalam sintesis klorofil, konversi energi pada fotosintesis dan respirasi pada sistem sitokrom.

·         Mangan merupakan elemen esensial yang terdapat pada klorop;as, berperan sebagai aktifator enzim dengan bertindak sebagai perantara pada proses fosforilasi.

·         Seng berperan sebagai aktivator enzim penyusun klorofil, pemacu pembentukanzat pengatur tumbuh tanaman.

• Cuprum merupakan bagian dari enzim, yang bereaksi dengan fenolase, laktase, askorbat oksidase, serta ikut terlibat pada proses fotosintesis dan reduksi nitrat.

·         Molibdenum berperan dalam metabolisme nitrogen, ikut dalam metabolisme protein, sintesis asam askorbat.

·         Boron berperan dalam translckasi karbohidrat, pada diferensiasi seluler^, clan perkembangan, aktivator zat pengatur tumbuh.

·         Chlor berperan sebagai aktivator enzim.

2. Zat-zat Organik

Zat organik yang biasa ditambahkan pada media MS adalah gula, myo inositol, vitamin, asam amino, zat pengatur tumbuh.

·        Gula berfungsi sebagai sumber energi pertumbuhan. Pertumbuhan eksplan  dimulai dari luka bekas irisan yang akan terus membelah dan mengalarni diferensiasi,

·        Myo inositol berperan dalam reaksi-reaksi metabolik yang berhubungan dengan pembelahan dan diferensiasi.

·        Vitamin ditambahkan dalam media untuk mempercepat pertumbuhan dan diferensiasi kalus. Beberapa vitamin dalarn media MS adalah: Thiamin-HCl, Nicotinic acid, pyridoxin-HCI.

·        Asam amino merupakan sumber N organik yang lebih cepat dimanfaatkan daripada N anorganik. Asam amino dalam media MS adaiah Glycine.

·        Zat pengatur tumbuh sangat diperlukan sebagai komponen yang mengatur arah pertumbuhan tanaman. Zat pengatur tumbuh yang biasa dipergunakan dalam kultur jaringan adalah: auksin, sitokinin, serta kadang-kadang giberelin.

3. Senyawa Organik Kompleks

Beberapa ekstrak yang pernah dicoba da{am media kultur jaringan adalah: air kelapa, endosperm jagung, orange juice, tomato juice, kapri, pisang, kentang. Kelemahan senyawa ini adalah tidak diketahuinya komponen penyusun secara pasti, sehingga penggunaan dan konsentrasi hanya berdasarkan perkiraan saja.

4. Bahan Pemadat

Bahan pemadat yang sering dipergunakan adalah agar powder  10-15 g/I.

5. pH media

pH media berkisar 5,6 - 5,8. NaOH atau KOH dan HCI biasa dipergunakan pada waktu mengatur pH media.

B. Pembuatan Media MS

Untuk membuat media kultur jaringan, setiap komponen bahan kimia harus di timbang satu persatu. Langkah ini tidak praktis, sehingga dibuat stok media. Larutan stok disimpan dalam almari es dalam bentuk cairan. Kebersihan larutan stok harus dijaga.

1. Pembuatan Larutan stok

a. Larutan Stok A, I liter (50 kali konsentrasi)

Timbang NH₄N0₃, 83,50 gram, masukkan ke  gelas piala bersih yang berisi aquades kira-kira 700 ml, aduk sampai larut. Pindahkan da!am labu takar I liter yang telah dibilas aquades, tambahkan aquades hingga volume tepat 1 liter

·                   Larutan yang telah jadi dipindah ke botol bersih dan tutup rapat, beri label stok A.

·         Untuk membuat 1 liter media MS diperlukan 20 ml stok A (max. 2 bulan),

b. Larutan Stok  B, I liter (50 kali konsentrasi)

·         Timbang KNO₃, 95 g, larutkan dalam gelas piala yang berisi aquades 700 ml, aduk,  tuang dalam labu takar 1 liter dan tera  volume sampai 1 liter.

·         Larutan dipindah ke botol bersih, beri label stok B, tutup rapat (max. 2 bulan).

·         Untuk membuat 1 liter media MS diperlukan 20 ml larutan stok B.

c. Larutan stok C, 1 liter (100 kali konsentrasi)

·         Timbang CaCl₂.2H₂O 44 g, larutkan dalam 700 ml aquades dliam gelas piala, biarkan larutan dingin, pindah lee labu takar 1 liter, tambah aquades sampai 1 liter.

·         Pindahkan larutan ke botol bersih, tutup rapat, beri label stok C (max 2 bulan).

·         Untuk membuat 1 liter media MS diperlukan 10 ml larutan stok C.

d. Larutan stok D, 1 liter (100 kali konsentrasi)

• Timbang MgSO4.H₂O 37 g dan KH₂P0₄ 17 g, larutkan secara terpisah dalam 350 ml aquades.
• Setelah larut, tuang larutan dalam labu takar 1 liter tambah aquades sampai 1 liter, pindah ke boto!, beri label stok D, tutup rapat, simpan (max 2 bl).
• Untuk membuat media MS 1 liter dibutuhkan 10 ml stok D.

e. Larutan stok E, 1 liter (200 kali konsentrasi)

• Timbang FeSO₄.7H₂O 5,57 g dan Na₂EDTA 7,45 g,  larutkan secara terpisah, Larutan Na₂EDTA dipanaskan hingga 40-60⁰C selama beberapa menit, tambah larutan FeS0₄.7H₂0, aduk hingga campur, biarkan sampai dingin, masukkan ke labu takar 1 liter, tambah aquades sampai 1 liter, pindah ke botol, beri label stok E, tutup.
• Untuk membuat 1 liter media MS, diperlukan 5 ml larutan stok E. (max. 2 bulan)

f. Larutan stok F, hara mikro, 1 liter (200 kali konsentrasi)

·         Timbang MnSO₄.H₂O 3,380 g, ZnS0₄,,7H₂0 1.720 g, H₃BO₃ 1,240 g, KI 0,165 g,

CuS0₄,5H₂0 0,005 g. Na₂Mo₁.2H₂0 0,050 g, CoC1_2. 2H₂0   0,005 g.

·           Masukkan bahan satu persatu sampai larut ke dalam gelas piala yang berisi 700 ml

aquades. Setelah larut, masukkan ke labu takar dan volume ditambah hingga

1 liter.Pindahkan ke botol, tutup rapat, beri label Stok F , simpan (max. 2 bulan).

·           1 liter media MS membutuhkan 5 ml larutan stok F.

g. Larutan Stok G, Vitamin, 100 mI (1000 kaii konsentrasi)

·         Timbang Thiamin-HCI 0,01 0 g, Nicotinic acid 0,050 g, pyridoxin-HCI 0,050 g, Glycine 0,200 g; sernua bahan masukkan fabu takar 100 ml, volume awal kurang dari 50 ml, kocok hingga semua bahan larut, tambahkan aquades hingga 100 ml. Pindahkan ke botol, beri label stok G, tutup rapat, simpan (max. 2 minggu).

·                     satu liter media MS dasar membutuhkan 1 ml  stok G.

h. Larutan stok H, zat pengatur tumbuh

·         Auksin: timbang bahan 0,1 g, tuang di gls. piala 100 ml yang berlsi aquades 70 mI, t eteskan NaOH 1 N dengan hati-hati hingga bahan larut merata, pindahkan di labu takar 100 ml, tambah aquades hingga 100. ml, pindah ke botol, beri label, tutup rapat, simpan. Untuk kebutuhan 1 ppm auksin dalam 1 liter media, dibutuhkan 1 ml stok auksin.

·         Sitokinin: Timbang bahan 0,1 g, tuang di gelas piala 100 ml yang berisi 70 ml aquades. Tetesi dengan HC1 1 N, panaskan sebentar hingga bahan larut (jernih}, Setelah larut dan dingin, pindah ke labu takar dan tepatkan volume hingga 100 ml dengan aquades. Pindah ke botol, beri label, tutup rapat; simpan. Media 1 liter dengan 1 ppm membutuhkan 1 ml stok.

B.     Pembuatan Media MS

Pembuatan media MS dengan larutan stok dilakukan dengan pengenceran. Untuk itu perlu diketahui kebutuhan volume larutan stok. Misalnya 1 liter media MS dengan perlakuan 1 ppm auksin dan 2 ppm sitokinin; media padat dengan agar 8 g dan gula 30 g, sbb:

·        Siapkan 300 ml aquades dalam labu takar 1 liter. Tambahkan larutan stok sesuai pengencerannya (misal stok A 20 ml, dst.). Gula 30 g dilarutkan dalam 300 ml aquades, masukkan dalam labu takar, volume ditepatkan hingga 1 liter,

·        Larutan dipindahkan ke daiam tempat memanaskan (kapasitas 2x volume media),  pH 5,6 - 5,8. Tambahkan agar 10 g, media dimasak sampai agar larut dan jernih. Masukkan daiam botol-botol kultur atau tabung reaksi yang telah disterilisasi pada tekanan 1,5 atm. 60 menit, kira-kira 15 ml/wadah.

·        Tutup botol kultur rapat dengan Al foil atau plastik yang tahan panas, bubuhkan labet dengan spidol tahan panas dan air, sterilisasi dengan autoclave pada tekanan 1,2 atm selama 30 menit.

Bahan organik tambahan

•	Air kelapa muda 5 s/d 20%
•	Juice tomat 30%
•	Juice jeruk 30 %
•	Ekstrak pisang 5 s/d 20 %
•	Ekstrak yeast
•	Carbon aktif

Zat pengatur tumbuh

·         Auksin (IAA, IBA, NAA, 2.4-D) Konsentrasi penggunaan 0,001 -10 mg/It dilarutkan dengan menggunakan beberapa tetes NaOH 0,1 N.

·          Cytokinins (BA, 2iP, PBA, Zeatin, Kinetin) Konsentrasi 0,01-10 mg/It, dilarutkan dengan menggunakan beberapa tetes NaOH 0,1 N.

·          Gibberellins (GA3) dilarutkan dengan beberapa etanol 50%.

·          Ukuran-Ukuran

1 g = 1000 mg

1 mg = 1000  µg

1 L = 1000 ml

1 ml = 1000 µl.

1 ppm = (part per million) 1 mg / It

III.             TEKNIK ASEPTIK

            Keberhasilan kultur jaringan dibatasi oleh beberapa hal, salah satunya adalah kontaminasi, yang dapat terjadi setiap saat dalam masa kultur.

Kontaminasi  berasal dari sumber kontaminan:

1.      Eksplan : internal dan eksternal

2.      Organisme kecil yang masuk dalam media

3.      Botol kultur dan alat-alat tanam yang kurang steril

4.      Lingkungan kerja dan pelaksanaan.

Hal tersebut diatasi dengan:

v  Sterilisasi lingkungan kerja

v  Sterilisasi alat dan media

v  Sterilisasi bahan tanam

Sterilisasi Lingkungan kerja:

Entkas: Disterilisasi dengan lampu UV/disemprot alcohol 70% atau formalin.

Laminar Air Flow: Disterilisasi dengan aliran udara dengan blower, melalui filter HEPA (High Efficiency Particulate Air), alcohol 70%, UV 1 – 2 jam sebelum kerja.

Sterilisasi Alat dan Media:

Alat-alat logam, gelas serta media dengan autoclave 121°C, 17,5 psi (1,5 atm) selama 1 jam.

Alat-alat tanam: pinset, scalpel, gunting, blade dengan pencelupan alcohol dan / atau pemanasan.

Sterilisasi Bahan Tanam:

Inisiasi kultur: harus bebas kontaminan yang berupa  cendawan, bakteri, serangga, spora-spora. Hal ini karena di dalam media yang kaya gula, vitamin, mineral, akan tumbuh subur dan menutupi eksplan, sehingga eksplan mati. Juga cendawan yang subur akan mengeluarkan senyawa toksik.

Kontaminan pada eksplan dapat dibedakan:

v  kontaminan internal 

Disterilisasi dengan antibiotik dan fungisida

v  kontaminan eksternal.

Tergantung dari : jenis tanaman, bagian tanaman yang dipakai, morfologi permukaan, lingkungan tumbuh, musim waktu mengambil, umur tanaman, kondisi tanaman.. Karena sangat beragam, maka tidak ada prosedur standar sterilisasi untuk semua tanaman.

Dalam sterilisasi, bahan tanam dan kontaminan merupakan benda hidup. Kontaminan harus dihilangkan, tetapi bahan tanam harus tetap hidup. Oleh karena itu, bahan sterilisasi harus diperhatikan, jangan sampai mematikan bahan tanam. Bahan sterilisasi merupakan bahan yang toksik bagi tanaman sehingga perlu pembilasan berkali-kali.

Sterilisasi Eksplan

Ada berbagai cara sterilisasi eksplan, namun pada dasarnya dibedakan dua cara yaitu cara fisik dengan pembakaran/pemanasan dan cara kimiawi. Sterilisasi cara fisik dilakukan pada organ yang tebal, berdaging, berlapis­ lapis,  atau keras, misalnya pucuk batang tebu, umbi lapis, daun berdaging.

Sterilisasi cara kimiawi, ada berbagai zat kimia yang dapat digunakan untuk sterilisasi: Pemilihan dan konsentrasinya tergantung kontaminan dan kepekaan eksplan; Zat kimia yang digunakan harus dicuci sampai bersih.

Bahan kimia untuk sterilisasi eksplan

Bahan                                      Konsentrasi     Lama perendaman       Ket

Natrium hipokloride                 1 – 2 %           5 – 15 menit                N

Hidrogen peroksida                 3 – 10 %         5 – 15 menit                N

Perak nitrat                               1 %                 5 – 30 menit                NN

Fungisida                                2 g/l                2 - 30 menit                 N

Bakterisida                               2 g/l                10 - 30 menit               N

Mercurie chloride                    0,1 – 0,2 %     10 – 30 menit              NN

Alkohol                                   70 – 90 %        0,1 – 0,5 menit           

Ket: 

N : Beracun

Sterilisasi dan lnokulasi Eksplan

CARA KERJA :

A. Eksplant dari : daun, tunas, tunas keiki, embrio (biji)

1.      Eksplant yang akan ditanam pertama kali dicuci dengan air mengalir kemudian dengan aquadest. 

2.      Eksplan dipotong dengan skalpel steril dengan ukuran kira-kira 1 cm untuk setiap sisi (biji atau embrio tidak boleh dipotong).

3. Masukkan eksplant ke dalam Clorox 20 % + tween 20 dan gojok selama 10 rnenit, kemudian bilas dengan aquadest sebanyak 2 kali.
4. Kemudian masukan ke dalam Clorox 10% + tween 20 dan gojok selama 5 - 10 menit, cuci dengan aquadest sebanyak 2 kali.
5. Setelah itu masukkan ke dalam Clorox 5 % dan gojok selama 5 - 10 menit, bilas dengan aquadest sebanyak 3 kali.
6. Untuk biji yang keras atau mempunyai kulit yang keras, maupun biji monokotil dapat dilakukan pembakaran.
7. a. Untuk daun, potong daun dengan ukuran 0,5 - 1 cm dengan scalpel pada petridish.

  b. Untuk tunas potong bagian ujung tanaman ± sepanjang 1 -- 2 cm.

c. Untuk tunas keiki, potong tunas yang terbentuk

d. Untuk biji monokotil diambil embrionya.                '

e. Untuk biji dikotil biasanya langsung ditanam. Pada waktu sterilisasi buah tidak dibuka. Buah dibuka pada saat rnenanam.

7. Setelah eksplant dipotong kemudian tanam ke dalam botol kultur yang telah berisi media, setiap botol kultur berisi 4 - 10 eksplant, kemudian botol kultur ditutup.

8. Botol kultur di simpan dalam rak kultur di ruang inkubasi dan diamati setiap 3 hari sekali.

B. Eksplant dari jahe jahean, umbi - umbian, buah anggrek (biji apornixis), kuncup bunga, bonggol pisang, akar.

1.      Eksplant dicuci dengan air mengalir. Untuk eksplant yang berasal dari dalam tanah perlu disikat sampai bersih untuk rnenghilangkan tanah yang melekat, bila perlu menggunakan detergent dan kemudian bilas hingga bersih. 

2.      Eksplan yang sudah bersih direndam dalarn bakterisida selarna I hari, dalam fungisida 30 merit dan kemudian dibilas.

3.      Eksplant dimasukkan dalam Clorox 20 °% + tween 20 dan gojok selama 10 -- 15 menit, dan bilas dengan aquadest sebanyak 2 kali. Untuk bonggol pisang direndam dalam Clorox 40 % + tween 20 selama 5 menit, cuci bersih dengan pisau, masukkan ke Clorox 20%.  Bilas dengan aquades steril.

4.      Masukkan potongan eksplan ke dalam botol berisi media, permukaan yang teriris bersentuhan dengan media, botol ditutup rapat, inkubasikan pada rak inkubator dengan suhu dan intenritas cahaya yang sesuai.

5.      Setelah semua pekerjaan selesai, keluarkan semua peralatan dari entkas atau LAF, semprot dengan alkohol, matikan lampu.

6.      a. Untuk eksplant umbi-umbian cari matanya dan potong bentuk dadu dengan ukuran 0,5 - 1 cm^3.

b. Untuk jahe-jahean:ambil mata tunas  0.5 - 1cm³.

  c. Untuk buah anggrek sebelum dipotong dilakukan pembakaran seperti pembakaran eksplan yang lain. Potong ujung buahnya, ketuk buah ke dalam botol kultur atau ambil dengan pinset dan disebarkan.

d. Untuk eksplant bonggol pisang, potong mata tunas dengan ukuran 0,5 - 1 cm³.

e. Untuk mengambil kepala sari belah kuncup bunga dan ambil kepala sari dengan pinset dan tanam dalam botol kultur.

f. Untuk akar dipotong-potong dan langsung di tanam.

7. Setelah eksplant dipotong-potong, maka eksplan ditanam dalam botol media kemudian ditutup, diletakkan pada rak kultur dan diamati setiap tiga hari sekali.

 

IV.             MACAM KULTUR JARINGAN

            Dalam perkembangan selanjutnya, kultur jaringan tidak hanya menanam jaringan, akan tetapi juga berbagai bagian dari tumbuhan. Berdasarkan bahan tanam yang dipergunakan, maka kultur jaringan dibedakan menjadi:

1. Kultur  Organ

Keberhasilan pertama dalam kultur in vitro dicapai dalam praktek kultur organ. Dalam fisiologi tumbuhan, kultur organ dipergunakan untuk studi diferensiasi dan fungsi jaringan, karena eksplorasi kebutuhan nutrisi dan lingkungan dapat lebih tepat terlihat dalam kultur jaringan. Beberapa jenis kultur organ, antara lain adalah:

1. Kultur Akar: Adalah biakan tanaman menggunakan bahan tanam akar, pada umumnya ujung akar. Akar yang diperoleh dari tanaman yang tumbuh di lapangan sangat sulit disterilkan, sedangkan sterilisasi yang keras dengan bahan-bahan yang pekat untuk menghilangkan kontaminasi biasanya merusak tanaman. Oleh karena itu, dianjurkan pemakaian akar kecambah yang ditumbuhkan dalam keadaan aseptic. Akar adventif yang muncul dalam kalus juga dapat dipergunakan sebagai sumber eksplan.

2. Kultur Meristem: Adalah biakan tanaman menggunakan eksplan berupa jaringan-jaringan meristematik. Meristem yang dipergunakan dapat berupa meristem pucuk terminal atau meristem tunas aksiler. Kultur meristem diterapkan untuk tujuan perbanyakan tanaman, teutama tanaman hortikultura. Sel-sel meristem pada umumnya stabil, sehingga menghasilkan tanaman yang identik dengan donornya. Selain untuk tujuan perbanyakan, kultur meristem juga dipergunakan untuk eliminasi virus dari bahan tanam.

3. Kultur Pucuk :  Adalah biakan tanaman dengan menggunakan bahan tanam berupa ujung tunas daun dan batang berukuran sekitar 0,3 – 1,3 cm untuk mendapatkan bahan yang serupadengan induknya. Kultur pucuk merupakan dasar kegiatan perbanyakan dalam laboratorium komersial.

4. Kultur Embrio : Adalah biakan tanaman dengan menggunakan eksplan embrio. Kultur embrio ditujukan untuk membantu perkecambahan embrio menjadi tanaman lengkap. Kultur embrio diperlukan dalam embrio yang mempunyai masalah antara lain: Masa dormansi panjang,  embrio hibrida hasil silangan interspesifik yang inkompatibel dengan endospermnya,  embrio dengan endosperm yang rusak seperti kelapa koplyor, dan  embrio tanpa endosperm seperti pada anggrek. Kultur embrio sangat penting artinya dalam pemuliaan tanaman.

2. Kultur Kalus

Kalus adalah kumpulan sel yang tidak terdiferensiasi yang terjadi  dari sel-sel yang membelah diri secara terus menerus tapa diferensiasi. Kultur kalus bertujuan untuk memperoleh kalus dari eksplan yang diisolasi dan ditumbuhkan dalam lingkungan terkendali dan diharapkan memperbanyak diri secara terus menerus. Pada umumnya, kemampuan pembentukan kalus dari jaringan tergantung dari; Umur fisiologi jaringan pada waktu isolasi,  bagian tanaman yang dipakai, dan jenis tanaman.

3. Kultur Protoplas: Adalah biakan tanaman menggunakan bahan tanam protoplas. Protoplas adalah semua bagian sel hidup tanpa dinding sel. Kultur protoplas merupakan suatu system yang sesuai untuk mempelajari metabolisme sel. Sedangkan dalam praktisnya, kultur protoplas dipergunakan sebagai sumber protoplas untuk fusi sel, untuk perlakuan mutagen kimia, untuk seleksi bahan. Inisiasi kultur suspensi protoplas dari kalus merupakan cara yang paling sederhana dan banyak dilakukan.    

                                                                                                                                                                                

4. Kultur Anther : Adalah  biakan tanaman dari anther untuk mendapatkan tanaman haploid. teknik isolasi lebih mudah, tetapi ada kemungkinan diperoleh tanaman diploid yang berasal dari dinding anther atau jaringan konektivum.

5. Kultur Polen : Adalah biakan tanaman dari pollen atau tepung sari. Dalam kultur pollen, kepastian haploid lebih tinggi tetapikeberhasilan masih rendah.

6. Kultur Ovul : Disebut juga kultur bakal biji. Merupakan alternatif untuk spesies haploid yang tidak dapat diinduksi dari anther.

V.                MANFAAT KULTUR JARINGAN

Kultur jaringan adalah teknil perbanyakan modern di bidang pertanian yang dapat dimanfaatkan untuk hal-hal yang tidak dapat dilakukan secara konvensional. Beberapa manfaat kultur jaringan antara lain:

1.      Perbanyakan Tanaman

Kultur jaringan sangat bermanfaat untuk perbanyakan tanaman. Oleh karena itu, kultur jaringan dipergunakan untuk memperbanyak tanaman yang secara konvensional sulit dilaksanakan. Selain itu, untuk tujuan komersial, kultur jaringan dapat dimanfaatkan untuk mendapatkan plnlet dalam jumlah banyak dengan waktu yang relatif singkat.

2.      Penyediaan Tanaman Bebas Patogen

Pada tanaman yang terserang oleh sejenis virus, masih ada bagian tanaman di ujung meristem yang masih bebas virus. Sehingga usaha untuk memperoleh tanaman bebas patogen ini dengan menggunakan kultur meristem. Luas meristem ujung  yang bebas virus ini tergantung jenis tanamannya, bervariasi dari 100 – 500 µm. Pada meristem apical jagung mencapai 2 cm.

3.      Pengawetan Plasma Nutfah

Plasma nutfah atau germplasm adalah tanaman atau hewan yang dahulu pernah dan dapat memenuhi kebutuhan manusia, tanaman yang sekarang ada dan diperlukan untuk memenuhi kebuituhan manusia, dan tumbuh-tumbuhan yang diperkirakan nantinya akan berguna untuk memenuhi kebutuhan manusia.  Di pusat-pusat penyimpanan plasma nutfah, disimpan biji-biji atau bagian vegetatif seperti akar rimpang, umbi, atau bagian lain, disimpan selama berbulan-bulan, atau bertahun-tahun, tegantung tanamannya atau bagian tanamannya untuk nantinya dapat ditumbuhkan kembali seperti sediakala. Dasar pemikiran pengawetan plasma nutfah atau germplasm preservation mendasarkan atas penekanan growthrate sampai sekecil mungkin, jika dapat malahan sampai nol atau zero  atau minimal growth rate.

4.      Produksi Metabolit Sekunder

Dalam dunia farmasi, teknik kultur jaringan sudah berkembang pesat dalam menghasilkan metabolit sekunder. Senyawa tertentu diekstrak dari sel yang dibiakkan terus menerus secara masal. Cara ini lebih efisien daripada menanam tanaman obatnya, karena tidak memerlukan lahan luas dan tidak tergantung musim.

5.      Usaha mendapatkan Tanaman yang Toleran terhadap Stress

Lingkungan ekstrem merupakan lingkungan yang dapat menimbulkan stress bagi tanaman sehingga tanaman tidak tahan dan mati. Keadaan ini misalnya adalah  daerah yang berkadar garam tinggi. Pada tempat seperti ini dibutuhkan tanaman yang toleran terhadap kadar garam atau salt tolerance. Cara memperoleh tanaman yang toleran terhadap kadar garam salah satunya adalah dengan teknik kultur jaringan.

6.      Persilangan somatic dalam Pemuliaan Tanaman

Persilangan somatic melalui kultur jaringan dilakukan dengan fusi sel. Teknik ini menggunakan cara kultur protoplas.

Silangan somatik /Fusi Protoplas

Silangan somatik dalam kultur jaringan dilakukan dengan cara fusi protoplas.  Tahapan yang digunakan adalah: 1) Isolasi protoplas, 2) Fusi protoplas 3) pemeliharaan.

1)      Isolasi Protoplas

Protoplas adalah semua bagian sel hidup tanpa dinding sel. Selain untuk kepentingan fusi sel, isolasi protoplas juga dipergunakan untuk kepentingn transfer gen / cloning gen. Dalam isolasi protoplas, maka protoplas yang digunakan harus hidup, melalui pemeriksaan dengan penanda fluorescein dan dilihat dengan penyinaran ultra violet untuk mengetahui viabilitas protoplas.

Pelaksanaan isolasi protoplas sebagai berikut:

a)      Tahap persiapan

1. Mempersiapkan Elution Medium (EM). Medium EM adalah campuran larutan enzim yang bertujuan untuk maserasi jaringan tanaman agar sel-sel tunggal saling terlepas dan melarutkan dinding sel yang masih tersisa. Untuk maserasi biasanya dipakai pectinase, pectyolase, macerozym serta selulase. Contoh EM sebagai berikut:

Cellulase	2,0 – 2,5%
Rhozym	0,1 – 0,5%
Dricellase	0,1 – 0,5%
Pectinase	0,1 – 0,5%
pH	5,6

2. Mempersiapkan Plasmolyzing agent. Plasmolyzing agent juga dinamakan osmolytic stabilizer atau membrane stabilyzer. Tujuannya adalah untuk mendapatkan protoplas yang utuh dan masih berfungsi. eksplantat yang akan diisolasi protoplasnya dimasukkan ke dalam plasmolyzing agent agar terjadi plasmolisis pada sel-sel eksplan. Setelah terjadi plasmolisis, eksplan dipindahkan ke EM medium. Purifikasi larutan dilakukan dengan sentrifugasi 7500 g selama 5 menit, sedangkan sterilisasi larutan dikerjakan dengan MF-filter. Osmolitic stabilizer antara lain adalah manitol 10 – 13% atau manitol – sorbitol masing-masing 0,3 M – 0,5 M.
3. Mempersiapkan medium pencuci protplas (WM medium). Setelah eksplan diperlakukan dengan EM medium, maka terjadi debris yang melayang di permukaan EM medium. Oleh akrena itu, dilakukan pencucian dengan WM-medium.

b)      Pelaksanaan isolasi protoplas

2)      Fusi protoplas

3)      Pemeliharaan